作者：江西中医药大学药学院 周年

正常骨组织处于一种以破骨细胞吸收骨组织和成骨细胞形成骨组织相协调的不断重建的动态平衡过程。激素、脂氧化物、生长因子以及炎症细胞因子等可影响成骨细胞和破骨细胞的活化、分化、增殖和成熟而改变骨重建过程，打破骨吸收和骨形成间的平衡产生骨质疏松症。据报道到2025年，仅美国因骨质疏松症引起的骨折发生率就将高达每年300万例，因此骨质疏松症已成为影响人们生活质量的流行病之一。雌激素缺乏一度被认为是导致骨质疏松症的主要原因，然而补充雌激素骨质疏松症并未得到明显改善。越来越多的研究发现ROS可能是骨质疏松症发生的主要根源，其诱导的氧化应激在骨质疏松症中发挥重要作用。因此骨质疏松症的治疗焦点开始从“以雌激素为中心”转向“以氧化应激为中心”.

氧化应激的产生

ROS主要是细胞线粒体在传递电子提供能量过程中产生，如超氧负离子（O2-）、羟自由基（OH-）和过氧化氢（H2O2）等。当然，在应对细胞外界**如生长因子等时，通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（Nox1）、环氧合酶及脂氧合酶等也可产生ROS.同时，机体还存在一套抵御ROS的防卫系统，两者间保持动态平衡。这一系统包括酶及转录因子依赖的抗氧化酶系统以及细胞自身存在的自噬作用，前者主要是超氧化物歧化酶、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶、叉形头转录因子O亚型（FoxO）转录引起的抗氧化酶基因等的表达。

ROS可激活c-Jun氨基端激酶（JNK）通路使FoxO转录因子磷酸化，并从胞浆释入胞核，激活核上FoxO介导的抗氧化酶如锰超氧化物歧化酶（MnSOD）、CAT基因的表达，延长细胞静息期，从而保护静息细胞不受氧化损伤。然而过多的ROS激活FoxO转录还可削弱有限的β-连环蛋白（β-catenin）向T细胞转换因子/淋巴增强因子（TCF/LEF）转录，降低成骨细胞生成。

因此在正常情况仅依靠前者不足以**由于ROS导致的细胞内损伤，后者即为通过泛素蛋白酶体或溶酶体途径修复或移除因细胞内过多ROS引起的功能异常的细胞器和蛋白质，以保证细胞健康的进一步防卫。通过其自噬作用可降解损伤的线粒体，打破损伤线粒体再次产生过多ROS的恶性循环，一定程度上维护骨形成和骨吸收间的平衡。机体由于衰老、疾病等原因后线粒体损伤加剧，而防卫机制减弱，使得ROS产生与ROS清除间的平衡被打破，氧化应激随即产生。

通常，在氧化应激条件下，线粒体内膜释放出一种可调节蛋白p66shc,在传递电子过程中作为氧化还原酶将O2还原为H2O2,后者对诱导成骨细胞凋亡起到相当关键的信号作用。ROS通过对多种细胞因子、酶活性的激活或抑制和上调或下调受体配体的表达调控多条信号通路，最终影响核内基因表达，促进BMSCs、成骨细胞、骨细胞的凋亡和破骨细胞的增殖及分化，使得骨形成速率相对骨吸收速率滞后，导致骨重建平衡被打破。

氧化应激对骨质疏松症的影响

氧化应激对骨形成相关细胞的影响

氧化应激对BMSCs的影响：BMSCs具有多向分化的趋势，其向成骨细胞分化同时还可向脂肪细胞和软骨细胞分化。经典Wnt/β-catenin通路在BMSCs定向分化中起到相当重要的作用，其主要过抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）的表达，阻止BMSCs向脂肪细胞和软骨细胞分化。

研究表明：去除成人老鼠前成骨细胞β-catenin后可引起PPARγ表达增加，骨量减少及骨髓脂肪化。机体由于衰老产生氧化应激后，过多的ROS不仅使得BMSCs向成骨细胞分化能力降低，同时还削弱其增殖能力，延长其静息期，导致成骨细胞生成减少。据报道源于老年鼠的BMSCs与年轻鼠相比，胞内呈现出高水平的脂氧化物及低活力的抗氧化酶。此外，源于早年衰老综合症病人的BMSCs显现出其分化能力的缺陷。

ROS影响BMSCs的增殖和定向分化主要是通过氧化不饱和脂肪酸（PUFAs）激活ROS/FoxO/PPARγ/β-catenin通路而实现的，其使得胞内脂氧合酶花生四烯酸15表达增加，后者氧化PUFAs产生脂氧化物，激活PPARγ表达并产生一种促氧化剂4-羟基壬烯醛继而产生更多的ROS.过多的ROS通过激活FoxO转录和ROS作用产物脂氧化物通过激活PPARγ表达，两者共同削弱Wnt/-catenin向TCF/LEF转录。由此可见，ROS通过氧化PUFAs激活ROS/FoxO/PPARγ/β-catenin通路削弱BMSCs向成骨细胞定向分化并抑制其增殖能力，减少成骨细胞生成，从而影响骨形成作用。

氧化应激对成骨细胞的影响：成骨细胞由BMSCs分化而来，是骨形成的功能细胞。Wnt/β-catenin通路促进BMSCs定向分化为成骨细胞的同时还可加快成熟成骨细胞矿化和骨基质形成速率。稳定表达的β-catenin进入核内与TCF/LEF转录因子结合启动早期成骨细胞分化标志基因Runx2表达，后者可调控成骨细胞的特异性基因如碱性磷酸酶、骨钙蛋白、骨桥蛋白及Ⅰ型胶原蛋白基因等表达，促进成骨细胞成熟。Ⅰ型胶原蛋白引导局部一定浓度的磷酸盐和钙沉积形成羟磷灰石发生矿化形成骨基质。ROS对成骨细胞产生促凋亡机制主要作用于p66shc和FoxO转录因子。

MariaA等人通过对UAMS-32细胞加入一种能阻断H2O2诱导p66shc磷酸化的阻断剂Ly333531处理后，发现H2O2诱导成骨细胞凋亡作用被阻断，接着加入一种蛋白激酶C（PKC）β强激活剂佛波酯（PMA），发现可扭转前者阻断效应。通过慢病毒传导使用短发夹RNA使p66shc沉默后，PMA激活的凋亡效应及核转录因子-κB（NF-κB）转录均可被阻断。由此可推测出ROS是通过激活PKCβ诱使可调节p66shc丝氨酸（Ser36）磷酸化，并使其从胞质进入线粒体，放大H2O2的产生以及激活JNK通路诱使成骨细胞凋亡。

此外，研究发现ROS也可通过磷酸化肿瘤抑制蛋白p53,使调节蛋白p66shc磷酸化，将ROS信号转化为对成骨细胞的凋亡作用，同时p53也能直接抑制成骨细胞分化标志基因Runx2和Osterix的表达。磷酸化的p66shc还可激活下游不同的效应分子I-κB并使其磷酸化，将NF-κB释放入核，激活成骨细胞内的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6基因表达。TNF-α能够抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Akt）通路的激活抑制FoxO磷酸化，使其停留在核内，激活FoxO转录表达抗氧化酶如MnSOD、CAT基因，延长静息期，对成骨细胞起到保护作用。

然而过多的ROS通过激活FoxO转录还可将有限的β-catenin从TCF/LEF转录转向FoxO转录，降低成骨细胞的形成。综合以上发现，ROS不仅通过PKCβ/p53/p66shc/JNK诱导成骨细胞凋亡，还通过激活JNK通路及抑制Akt通路共同将Wnt/β-catenin信号通路中TCF/LEF转录转向FoxO转录，降低成骨细胞的生成，最终减少成骨细胞数量，降低骨形成作用，引起骨质疏松症。

氧化应激对骨细胞的影响：骨细胞来源于在皮质和网状骨质的骨重建过程中，小部分成骨细胞嵌入骨基质中而形成。其既能接触到骨表面，还能延伸至骨髓室，形成主要为骨陷窝小管系统的骨网络，作为一种对机械承载力高度灵敏的传感器来影响骨重建。

过去认为骨细胞仅仅是包埋在矿化骨基质中的支撑物——即“懒惰”细胞，然而越来越多的研究发现其通过调节破骨生成因子核因子κB受体活化因子配体（RANKL）和骨保护素（OPG）来影响骨吸收和激活SOST基因表达，从而促进硬化蛋白（Sclerostin）生成来影响骨形成，同时它通过牙基质蛋白1和成纤维生长因子23来调节骨内磷酸盐的平衡。

因此，骨细胞开始作为协调骨及矿物代谢的多功能细胞，俨然已成为骨质疏松研究中的热点。骨细胞作为长寿命细胞，较成骨及破骨细胞更易受到氧化应激的影响。大量在啮齿动物和人体中的实验表明：随着机体衰老后引起氧化应激，骨细胞的数量逐渐减少且生存能力减弱。Halloran与其同事从C57BL/6老鼠中发现衰老后的老鼠骨细胞数量减少且骨髓中可溶性的RANKL与Sclerostin水平降低。

然而，尽管RANKL水平降低与衰老后网状骨质破骨细胞减少的结果一致，但Sclerostin水平降低从而促进Wnt成骨通路激活却与衰老后成骨细胞数量减少相矛盾。ShahnazariM等人通过对衰老老鼠骨髓中的骨代谢生化标记物检测发现，骨髓中的生化标记物水平变化仅能反应骨小梁网状骨丢失情况，成骨细胞抑制因子Sclerostin水平降低可能是一种对衰老导致成骨细胞谱系静息的代偿反应，其可能通过促进造骨祖细胞增殖或分化来缓解由于衰老导致的成骨细胞活力降低。

氧化应激对破骨细胞的影响

破骨细胞来源于骨髓造血干细胞中单核巨噬细胞系。ROS对破骨细胞的影响不同于对骨形成相关细胞的直接影响，而是通过**骨形成相关细胞产生OPG、巨噬细胞集落**因子（M-CSF）和RANKL等重要调节因子，识别破骨细胞前体细胞及破骨细胞传导骨吸收信号，间接地影响破骨细胞的分化、生存和活化。M-CSF和RANKL是破骨细胞生成的两种必需因子，它们能促进破骨细胞分化与增殖，阻止破骨细胞凋亡并延长其寿命，促进破骨细胞成熟，引起破骨细胞标志基因如抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）、降钙素受体等的表达，最终向细胞外定向分泌HCl和溶解酶，使得骨组织脱矿、降解及溶解，形成骨陷窝。

研究表明，RANKL/核因子κB受体活化因子（RANK）/OPG是影响破骨细胞分化、成熟的主要通路。ROS、激素、生长因子和细胞因子等如活性维生素D3、雌激素、甲状旁腺素、转化生长因子-β、骨形态发生蛋白-2、IL-6、TNF-α等都是通过调节OPG、RANKL介导破骨细胞生成。RANKL/RANK/OPG信号作为Wnt/β-catenin信号通路的下游部分，与骨质疏松症的发生、发展存在密切相关性。

氧化应激条件下，ROS将Wnt/β-catenin信号通路中TCF/LEF转录转向FoxO转录，抑制成骨细胞的生成和分化，促进成骨细胞凋亡的同时也下调OPG和上调RANKL的表达，使成骨细胞OPG和RANKL表达失偶联。RANKL与它的同族特异性受体RANK结合，激活NF-κB、JNK、细胞外信号调节激酶（ERK）和Akt通路，诱导破骨细胞重要的转录因子包括原癌基因c-fos、T细胞核因子c1等的表达，**破骨细胞前体分化，活化成熟的破骨细胞，阻止破骨细胞凋亡。同时在破骨细胞内，RANKL可通过肿瘤坏死因子受体相关因子6/Ras相关的C3肉毒底物1/Nox1（TRAF6/Rac1/Nox1）途径产生ROS,直接参与骨基质的降解。

氧化应激对骨基质的影响

骨组织中的细胞外基质包括有机成分和无机成分，有机成分主要为各种胶原蛋白，无机成分为羟磷灰石结晶。异常增多的ROS和破骨细胞内的基质金属蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶能损伤蛋白质的巯基和氨基，使蛋白质变性与交联，破坏胶原和纤维连接蛋白。破骨细胞内分泌的TRACP能够溶解无机成分，致使骨基质脱矿。此外，破骨细胞通过NADPH/NADP+氧化酶系统直接产生ROS,参与骨基质的降解。值得注意的是，许多生长因子如胰岛素类生长因子-1（IGF-1）富含于骨基质中，其能通过磷脂酰肌醇激酶/Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）途径促进BMSCs定向分化，然而这种促骨形成作用又是由ROS及破骨细胞的降解基质介导的。

抗氧化治疗对骨质疏松症的预后

ROS通过激活PKCβ/p53/p66shc/JNK信号通路诱导成骨细胞凋亡，雌激素则通过抑制PKCβ诱导的p66shc磷酸化机制阻断ROS引起的成骨细胞凋亡。因此可以推测出氧化应激可能是隐藏于与衰老相关的骨量减少、骨脆性增加的骨质疏松症的主要病因。雌激素随机体衰老减少，其抗氧化作用逐渐减弱，机体便加快了衰老对骨的作用。目前治疗骨质疏松症的药物大多从抗氧化剂着手，但大多数抗氧化剂机制仅仅局限在消除自由基的基础和影响细胞信号通路的表象上，并未涉及到对作用位点的生物大分子的具体结构和控制基因表达的研究上。

总结与展望

综合上述发现，在氧化应激条件下，ROS一方面氧化PUFAs激活ROS/FoxO/PPARγ/β-catenin途径削弱BMSCs向成骨细胞定向分化及抑制其增殖，PKCβ/p53/p66shc/JNK途径诱导成骨细胞凋亡，并激活JNK通路及抑制Akt通路共同将Wnt/β-catenin信号通路中TCF/LEF转录转向FoxO转录，降低成骨细胞的骨形成作用。另一方面，上调骨形成相关细胞表面RANKL的表达，促进破骨细胞分化及成熟并直接或间接参与骨基质的降解，最终打破骨吸收和骨形成之间的骨重建平衡，引起骨质疏松症。

然而其中许多作用机制如氧化应激对骨细胞的作用有待进一步的深入研究。此外，骨质疏松症发生及发展涉及多条通路，各个通路间存在信号串话的情况，但现今的文献没有对其相关联的通路有一个系统且清晰的概括。因此，有必要对通路中涉及到的多种受体配体、生长因子、转录因子、基因调控以及通路之间的关系进行大量研究，便于更好的指导临床应用和新药研发。