基因治疗则为血友病的长期缓解乃至治愈带来了希望。靶组织或细胞选择范围广泛、FⅨ基因片段小、低水平表达即可明显改善出血、具有良好的动物模型等优势，使得血友病B成为基因治疗领域进展最为迅速的疾病之一。

血友病B是一种X染色体连锁隐性遗传病，因编码基因的改变而导致凝血因子Ⅸ（FⅨ）的缺乏。在男性中发病率约为1/25 000 ,依据血浆FⅨ活性（FⅨ∶C）分为重型（FⅨ∶C<1%）、中间型（F Ⅸ∶C 1%——5%）和轻型（F Ⅸ∶C >5% ,≤40%）。

目前该病主要治疗手段为替代治疗（输注血浆提取物或重组FⅨ制剂），但反复输注外源性FⅨ可引起FⅨ抑制物形成、血制品输注相关疾病且医疗费用昂贵。


一。载体系统

1.腺相关病毒载体：腺相关病毒载体（AAV）是目前血友病B基因治疗最有前景的载体。AAV是一种可感染人细胞、具有天然复制缺陷的单链DNA 病毒，与已知人类疾病无关。AAV较之其他病毒载体具有免疫原性弱、转染效率高、可转染非分裂细胞、表达稳定且持续时间长等优点，缺点为容量小、基因表达滞后。

AAV包括AAV1、2、5、6、7、8、9 等多种血清型。AAV2 是应用最早、最广泛的血清型，可有效转染多种细胞，但人类是AAV2的天然宿主，人群中AAV2血清抗体阳性者较为常见。其他几种血清型则有不同的转染趋向性：AAV1具有明显的骨骼肌趋向性，AAV6具有心肌趋向性，AAV8具有明显的肝趋向性。针对不同的靶组织可以考虑选择趋向性不同的AAV.

总体而言，AAV7、8、9 产生的免疫反应较AAV1、2、5 轻。Wang 等分别应用AAV1、2、5、7、8、9 对FⅨ基因敲除小鼠和患血友病B犬进行基因治疗，然后对血浆中FⅨ∶C、抗FⅨ特异性IgG1 和IFN-γ进行检测，以比较其转染效率和免疫反应。

结果显示以肌肉组织作为靶组织时，AAV7、8、9 转染效率高于AAV1、2、5,未发现针对导入的FⅨ基因的B细胞反应，针对病毒衣壳蛋白的T细胞反应程度亦较弱。自身互补AAV 载体（self-complementaryAAV, scAAV）的发明则弥补了传统单链AAV 载体（singlestrandedAAV, ssAAV）表达滞后的缺点。

ssAAV表达滞后的原因在于其进入靶细胞并脱壳后，首先要合成互补DNA链才能进一步表达。scAAV则是将载体基因设计成1 个单链反向重复序列，当载体进入靶细胞后即可折叠形成1 条互补双链，从而绕开影响基因表达速度的步骤。

Nathwani 等采用scAAV5 和scAAV8 作为携带FⅨ编码基因的载体对患血友病B猕猴进行基因治疗并研究其安全性。研究者将猕猴分为5 组，分别从外周静脉注射2×109——2×1012 载体基因组（vg）/kg 共5 个剂量级的载体，然后对基因表达效率和安全性进行了长达5 年的观察。

研究发现，当载体剂量达到6×1010 vg/kg 时，猕猴血浆FⅨ∶C维持在1%以上；所有的猕猴均产生了血清型特异性抗体，未发现衣壳蛋白特异性T细胞反应和免疫介导的肝损伤，同时没有观察到AAV基因整合到靶细胞基因序列中和肝脏肿瘤的发生。该研究及大量制备scAAV的方法为临床试验打下了基础。AAV的缺点为包装容量较小，影响了在血友病A等其他基因缺陷性疾病的应用。

2.逆转录病毒载体：

逆转录病毒载体（RV）是最早应用于基因治疗的病毒载体，但仅对分裂细胞有效，对非分裂细胞则无效。Zhang 等以RV作为载体、以肝脏作为靶组织对新生血友病B犬和新生基因敲除血友病B小鼠进行基因治疗，结果显示所有动物中FⅨ∶C>10%,无FⅨ抑制物形成。

但成年动物的肝脏中分裂细胞不足，有报道以手术切除部分肝脏的方法诱导肝细胞增殖，再应用RV进行基因治疗，但该治疗方法创伤较大，与其他载体相比劣势较为明显。

3.腺病毒载体：

腺病毒载体（AV）可转染分裂细胞和非分裂细胞。腺病毒基因不与宿主基因整合，不会因为基因整合而导致抑癌基因失活。人群可天然感染腺病毒而易预存免疫反应。第二代AV（高容量AV）腺病毒本身的编码基因被去除，可以降低宿主免疫反应，延长导入基因表达持续的时间。

4.慢病毒载体：

慢病毒载体（LV）是以HIV-1 为基础发展起来的基因治疗载体，可转基因至分裂细胞和非分裂细胞，对包括肝在内的各种组织都可转染，也可将载体基因整合至宿主基因中。因为LV来源于HIV,在普通人群中少有感染，很少有预存免疫反应，在基因治疗上具有一定的优势。

但是应用LV作为载体进行基因治疗时，FⅨ∶C仅接近1%,且有一过性急性促炎性免疫反应发生。Brown等应用携带肝细胞特异性启动子的LV载体对基因敲除血友病B小鼠进行治疗，FⅨ∶C因抗FⅨ的T细胞反应而未达治疗水平（<1%），当他们在载体中再包进一段造血特异性miRNA后进行基因治疗，小鼠体内FⅨ∶C持续高于15%且未发生明显的免疫反应，分析认为，miRNA可能在T细胞反应的免疫失活中起了重要作用。

Mátrai 等报道应用整合酶缺陷的慢病毒载体对基因敲除血友病B小鼠进行基因治疗，在基因有效表达的前提下诱导抗原特异性免疫耐受，并降低基因插入诱变的风险。

5. 非病毒载体系统：

非病毒载体包括脂质体、纳米材料、沉默转座子、质粒DNA注射等，具有来源广泛、成分明确、免疫反应低、可大量制备等优点。而缺点在于转染效率低、FⅨ难以长期表达。

Miao 等报道显示小鼠肝内注射裸质粒DNA的同时结合超声波空化可以显著提高转染效率。经小鼠尾静脉高压注射编码FⅨ的裸质粒DNA,达到了良好效果。相比较其他非病毒载体，沉默转座子可以使FⅨ基因整合到宿主基因而长期表达，显示出一定的发展优势。

二。靶点的选择

1.肝脏：肝脏是产生FⅨ的主要器官，是基因治疗较为理想的靶器官。早期通过肝动脉或门静脉注射载体，一些具有肝趋向性的新载体（如AAV8）可采用静脉注射，使治疗过程简化、风险降低。血友病B（尤其是重型）患者常因为血制品输注而并发肝炎，不宜选择肝脏作为靶器官。

2.肌肉组织：肌肉组织是FⅨ的异位合成组织，也是一个重要的治疗靶点，对于合并肝炎的患者尤为适合。载体一般采用多部位肌肉注射，肌肉组织中可长期表达FⅨ。

Buchlis 等报道1 例血友病B患者在接受基因治疗（载体为AAV2 肌肉注射）10 年后因非治疗相关原因死亡，注射部位肌肉组织仍可表达FⅨ，但由于免疫反应，该患者血浆FⅨ∶C未达治疗水平。

采用加压注射或合并使用血管活性药物的静脉灌注给药法（ATVRX）可使载体在肌肉组织中广泛分布。短程应用环磷酰胺以抑制免疫反应可使血浆FⅨ∶C持续维持在治疗水平以上，且安全性较为理想。

3.造血干细胞、红细胞和血小板：除了传统的靶组织，有研究者致力于FⅨ基因异位表达的探索。Bigger 等以慢病毒作为载体，体外转染小鼠造血干细胞，再植入经致死量照射的普通小鼠及基因敲除血友病B小鼠体内，结果受鼠体内表达FⅨ持续1 年以上；再将受鼠的造血干细胞进行二次和三次移植，二次或三次移植受鼠也可长期表达FⅨ，凝血功能得到显著改善。

另有报道使FⅨ表达于干细胞来源的红细胞，也获得良好效果。Zhang 等建立2bF9 转基因小鼠模型，使其FⅨ异位表达于血小板和巨核细胞，并储存在α颗粒中，虽然血浆FⅨ∶C仅1.1%,但其中90%的FⅨ位于血小板，当血小板激活后FⅨ可立即释放到出血部位，止血效果优于普通FⅨ，且具有更长的半衰期。该研究中转基因小鼠未发生肿瘤和血栓性事件。这些研究为血友病B的基因治疗开拓了思路。

三。安全性

1.免疫反应：免疫反应是影响基因治疗成败的关键。病毒衣壳、导入的载体基因、启动子元件和增强子元件、载体剂量、靶点的选择、是否合并肝炎以及先前有无FⅨ抑制物均为影响免疫反应的因素。衣壳蛋白特异性T 细胞反应和针对转入基因的免疫反应在动物实验和临床试验中均为常见。

在以AAV作为载体的基因治疗中，针对病毒衣壳蛋白的免疫反应则是导致FⅨ表达进行性减少的原因。有研究显示作为靶器官的肝脏中CD8+细胞浸润较肌肉少见，分析认为与肝脏中调节性T 细胞（Treg）形成的免疫耐受有关。

目前减低和应对免疫反应的策略还有：①减少载体中的空衣壳数量；②应用高表达FⅨ的转基因，如FⅨPadua（R338L），则可用较少载体就达到同样疗效；③在基因治疗中短程应用免疫抑制剂；④持续监测，一旦出现免疫反应及时给予糖皮质激素。

2.基因插入突变：载体基因若随机整合进宿主基因，可能引起基因插入突变。如整合到抑癌基因并致其失活，可增加肿瘤发生的危险。目前广泛应用的AAV载体，尚未发现宿主基因整合。

多项大规模动物实验结果大多证实AAV载体无诱发癌变倾向。如果载体基因随机整合到精子细胞，则可引起后代基因的改变，也就是所谓的种系传播，是人们对基因治疗的一个顾虑。但研究表明应用AAV2和AAV8靶向治疗后，动物精液中载体基因仅短暂存在，经过上百个生精循环后，精液中已无载体基因存在。

一般认为应用AAV2和AAV8基因治疗导致种系传播的风险较小。也有报道显示基因治疗增加了肝癌和其他恶性肿瘤的发生率。对于基因突变的安全性尚需继续观察和研究。

四。临床试验

Qiu 等在1996 年报道了世界首次血友病B基因治疗临床试验。研究者用带有FⅨ基因的逆转录病毒载体转染患者的离体皮肤成纤维细胞，筛选出表达FⅨ的细胞，经一系列安全性检测后用胶原包埋，于患者腹部或背部皮下注射。2 例患者体内血浆FⅨ水平升高2 倍多，持续超过1 年。没有出现明显的治疗相关不良反应。

Manno 等应用AAV2作为载体通过肌肉注射的方式对血友病B患者进行基因治疗，肌肉组织中FⅨ表达良好，但血浆FⅨ∶C<1%.通过肝动脉注射将AAV2注入血友病B患者体内，血浆FⅨ∶C达治疗水平，但8 周后逐渐下降并伴有转氨酶升高，认为与衣壳蛋白引起的细胞免疫反应相关。

最近一则令人振奋的消息来自于英国伦敦大学学院的临床试验。入组的6例无FⅨ抑制物的重型血友病B患者脉注射三种剂量的scAAV8载体，所有患者外周血FⅨ∶C均达治疗水平，未产生FⅨ抑制物，也没有发现针对FⅨ基因的T细胞免疫反应，但在所有患者中均发现针对AAV8衣壳蛋白的体液免疫反应，中、高剂量组的患者中还出现AAV8衣壳蛋白特异性T细胞反应。

高剂量组的2例患者出现了衣壳蛋白特异性T细胞反应引起的转氨酶升高，给予短程糖皮质激素治疗后恢复正常，而且FⅨ∶C仍然维持治疗水平。综上所述，近年来血友病B 的基因治疗取得了很大进展。今后需要进行更多的动物实验以验证安全性并谨慎、严格地开展大规模临床试验。