成体干细胞的研究目前以造血干细胞和骨髓间充质干细胞(BMSC)为主，但取材困难，获得率低等不利因素使其临床应用受限。继BMSC之后，脂肪源干细胞(ADSC)成为当今干细胞研究领域的又一热点，美国的ZUK及日本的Mizuno等研究小组对此做了深入研究并取得了一定的进展。ADSC与BMSC有许多相似的生物学特性，但ADSC还具有取材方便、易于培养、收获细胞量大的优势。研究表明BMSC在造血调控中起着关键的作用，而BMSC与造血干细胞共移植能够促进造血重建，原因在于分泌基质细胞衍生因子-1(SDF-1)。但ADSC是否可作为滋养层与骨髓细胞共培养刺激造血干/祖细胞(HSPC)增殖却少见报道，为此我们以ADSC体外模拟造血微环境，观察其对自身HSPC增殖的作用。

一、实验方法

　1.大鼠ADSC分离培养：本实验鼠为SPF级SD大鼠，SD大鼠腹腔麻醉后，无菌条件下切取双侧腹股沟皮下脂肪，置人含有100 U/ml青霉素和100 U/m1链霉素的PBS液中浸泡10 min，用PBS反复冲洗，去除可见的血管及其他非脂肪组织，将脂肪组织剪成约1 mm3小块，置于10 ml的0.1%I型胶原酶中，37℃摇床120 r/min消化30min，至悬液成糊状，加入3倍体积的PBS终止消化，以1200×g离心10 min，弃上清，沉淀用含10%FBS的LG-DMEM培养液制成单细胞悬液。以2×105/cm2的密度接种于培养瓶中，置37℃、5%CO2培养箱中培养，48 h首次换液，以后每3 d换液1次。细胞汇合达80%时消化传代。

　2.用流式细胞术(FCM)检测ADSC免疫表型：分别取第3～6代细胞，用25 g/L胰蛋白酶消化后，PBS洗2次，制成1×106/ml的单细胞悬液，设阴性对照和同型对照组，分别加CD29-PE、CD34-PE、CD44-FITC、CD49d-FITC及CD106-PE单克隆抗体(单抗)，室温下避光孵育15 min，FCM检测。

　3.成骨细胞诱导分化：①诱导组取第3代ADSC，待细胞融合80%，加入成骨细胞诱导液(加10%FBS、0.1μmol/LJ也塞米松、50 μmol/L抗坏血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸钠的LG-DMEM)；②对照组：常规培养，每3 d换液1次。诱导7 d后，两组均行茜素红染色。

　4.成脂细胞诱导分化：①诱导组：取第3代ADSC，待细胞融合80%，加入成脂细胞诱导液(含10%FBS 1 μmol/L、地塞米松、200μmol/L吲哚美辛、0.5 mmol/L 3-异丁基1-甲基黄嘌呤、10 μmol/L胰岛素的LG-DMEM培养液)；②对照组：常规培养，隔日换液。诱导7 d后，两组均用油红O染色。

　5.BMSC对骨髓单个核细胞(BMNC)体外长期培养扩增影响的观察：取大鼠骨髓，制成单细胞悬液，用淋巴细胞分离液分离MNC，用LG-DMEM培养液调整细胞密度为5.0×105/ml，置于丝裂霉素C处理的BMSC上，共培养5周后用胰蛋白酶消化后重新接种，3 h后，收集上清中非贴壁细胞，甲基纤维素培养基(购白Stem cell公司)进行细胞集落培养，培养14 d计数分析。

　6.ADSC支持HSPC体外扩增能力的观察：将BMNC作为长期培养启动细胞(LTC-IC)，大鼠胚胎来源成纤维细胞、BMSC、ADSC作为滋养层。将实验分为四组：A组：单纯BMNC；B组：BMNC加成纤维细胞；C组：BMNC加BMSC；D组：BMNC加ADSC。在5%CO2、37 ℃、饱和湿度条件下进行培养，每7 d换HSPC长期培养液(购自Stem cell公司)，并于培养第7、14、28天取培养液中非贴壁细胞进行细胞集落培养和分析，并于35 d收集上清，用ELESA方法检测SDF-1，FCM检测CD34阳性细胞率。

二、结果

　1.ADSC的增殖特征：原代细胞培养48 h首次换液，可见有少量细胞贴壁生长，呈短小梭形，随培养时间延长，细胞呈簇状生长并汇合呈漩涡状排列，培养5～7 d传代，传至第6代(P6)细胞形态呈梭形、大小较一致(图1a)。

　2.ADSC的免疫表型：经FCM检测，CD34+细胞占(18.9±6.2)%，CD49d+细胞占(0.8±0.2)%，CD29+细胞占(99.1±0.5)%，HCAM+细胞占(1.6±0.7)%，CDl06+细胞占(5.7±2.1)%，对照组均为阴性。

　3.成脂细眙诱导升化：加入成脂细胞诱导培养养后2～3d，细胞开始回缩变为多角形，3 d后细胞质可见较少脂质，7 d时汇合为较太的脂质.油红O染包可见细胞脂滴染色呈阳性(图1b，)。

　4.成骨细胞诱导分化加：成骨细胞诱导培养基后3 d细胞逐渐停止扩增变成短梭形约，10d形成结节样结构，笫14天茜索红辨色呈阳性(图1 c)。

　　a:倒置显微镜下ADSC形态（×200）；b ：ADSC成脂诱导分化后油红O染色（×100）；c：ADSC成骨诱导分化后茜素红染色（×200）

图1 第3代脂肪源干细胞（ADSC）形态及成脂、成骨诱导分化后组化染色结果